IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) β-galactosidase ਸਬਸਟਰੇਟ ਦਾ ਇੱਕ ਐਨਾਲਾਗ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਇੰਡਿਊਸੀਬਲ ਹੈ। IPTG ਦੇ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਦੇ ਅਧੀਨ, ਇੰਡਿਊਸਰ ਰੀਪ੍ਰੈਸਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਕੰਪਲੈਕਸ ਬਣਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਰੀਪ੍ਰੈਸਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਬਣਤਰ ਬਦਲ ਜਾਵੇ, ਤਾਂ ਜੋ ਇਸਨੂੰ ਟਾਰਗੇਟ ਜੀਨ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਨਾ ਜਾ ਸਕੇ, ਅਤੇ ਟਾਰਗੇਟ ਜੀਨ ਨੂੰ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ। ਤਾਂ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੌਰਾਨ IPTG ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਕਿਵੇਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ? ਕੀ ਜਿੰਨਾ ਵੱਡਾ ਓਨਾ ਹੀ ਵਧੀਆ ਹੈ?
ਪਹਿਲਾਂ, ਆਓ IPTG ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਦੇ ਸਿਧਾਂਤ ਨੂੰ ਸਮਝੀਏ: E. coli ਦੇ ਲੈਕਟੋਜ਼ ਓਪਰੋਨ (ਤੱਤ) ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਢਾਂਚਾਗਤ ਜੀਨ, Z,Y, ਅਤੇ A ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕ੍ਰਮਵਾਰ β-galactosidase, permease, ਅਤੇ acetyltransferase ਨੂੰ ਏਨਕੋਡ ਕਰਦੇ ਹਨ। lacZ ਲੈਕਟੋਜ਼ ਨੂੰ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਅਤੇ ਗਲੈਕਟੋਜ਼, ਜਾਂ ਐਲੋ-ਲੈਕਟੋਜ਼ ਵਿੱਚ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ ਕਰਦਾ ਹੈ; lacY ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ ਲੈਕਟੋਜ਼ ਨੂੰ ਸੈੱਲ ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਣ ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੋਣ ਦਿੰਦਾ ਹੈ; lacA ਐਸੀਟਿਲ ਸਮੂਹ ਨੂੰ ਐਸੀਟਿਲ-CoA ਤੋਂ β-galactoside ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਜ਼ਹਿਰੀਲੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣਾ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਇੱਕ ਓਪਰੇਟਿੰਗ ਕ੍ਰਮ O, ਇੱਕ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕ੍ਰਮ P ਅਤੇ ਇੱਕ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਜੀਨ I ਹੈ। I ਜੀਨ ਕੋਡ ਇੱਕ ਰੀਪ੍ਰੈਸਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੈ ਜੋ ਆਪਰੇਟਰ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਸਥਿਤੀ O ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਓਪਰੋਨ (ਮੈਟਾ) ਨੂੰ ਦਬਾਇਆ ਅਤੇ ਬੰਦ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ। ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕ੍ਰਮ P ਦੇ ਉੱਪਰ ਵੱਲ ਕੈਟਾਬੋਲਿਕ ਜੀਨ ਐਕਟੀਵੇਟਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-CAP ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟ ਲਈ ਇੱਕ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟ ਵੀ ਹੈ। P ਕ੍ਰਮ, O ਕ੍ਰਮ ਅਤੇ CAP ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟ ਇਕੱਠੇ lac ਓਪਰੋਨ ਦੇ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਖੇਤਰ ਦਾ ਗਠਨ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਤਿੰਨਾਂ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੇ ਕੋਡਿੰਗ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਜੀਨ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੇ ਤਾਲਮੇਲ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕੋ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਖੇਤਰ ਦੁਆਰਾ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਲੈਕਟੋਜ਼ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ, ਲੈਕ ਓਪਰੇਨ (ਮੈਟਾ) ਦਮਨ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਸਮੇਂ, PI ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਅਧੀਨ I ਕ੍ਰਮ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਲੈਕ ਰੀਪ੍ਰੈਸਰ O ਕ੍ਰਮ ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ, ਜੋ RNA ਪੋਲੀਮੇਰੇਸ ਨੂੰ P ਕ੍ਰਮ ਨਾਲ ਜੁੜਨ ਤੋਂ ਰੋਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ; ਜਦੋਂ ਲੈਕਟੋਜ਼ ਮੌਜੂਦ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਲੈਕ ਓਪਰੇਨ (ਮੈਟਾ) ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਓਪਰੇਨ (ਮੈਟਾ) ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਵਿੱਚ, ਅਸਲ ਇੰਡਿਊਸਰ ਲੈਕਟੋਜ਼ ਖੁਦ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ। ਲੈਕਟੋਜ਼ ਸੈੱਲ ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ β-ਗੈਲੈਕਟੋਸੀਡੇਜ਼ ਦੁਆਰਾ ਐਲੋਲੈਕਟੋਜ਼ ਵਿੱਚ ਬਦਲਣ ਲਈ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਬਾਅਦ ਵਾਲਾ, ਇੱਕ ਇੰਡਿਊਸਰ ਅਣੂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, ਰੀਪ੍ਰੈਸਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਰੂਪਾਂਤਰਣ ਨੂੰ ਬਦਲਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ O ਕ੍ਰਮ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਰੀਪ੍ਰੈਸਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਵਿਛੋੜਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਆਈਸੋਪ੍ਰੋਪਾਈਲਥਿਓਗੈਲੈਕਟੋਸਾਈਡ (IPTG) ਦਾ ਐਲੋਲੈਕਟੋਜ਼ ਵਾਂਗ ਹੀ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਇਹ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਸ਼ਕਤੀਸ਼ਾਲੀ ਇੰਡਿਊਸਰ ਹੈ, ਜੋ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੁਆਰਾ ਮੈਟਾਬੋਲਾਈਜ਼ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ ਅਤੇ ਬਹੁਤ ਸਥਿਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਇਸਨੂੰ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
IPTG ਦੀ ਅਨੁਕੂਲ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਕਿਵੇਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰੀਏ? ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਣ ਵਜੋਂ E. coli ਲਓ।
ਈ. ਕੋਲਾਈ BL21 ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੰਜੀਨੀਅਰਡ ਸਟ੍ਰੇਨ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ pGEX (CGRP/msCT) ਸੀ, ਨੂੰ 50μg·mL-1 Amp ਵਾਲੇ LB ਤਰਲ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਰਾਤੋ-ਰਾਤ 37°C 'ਤੇ ਕਲਚਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਉਪਰੋਕਤ ਕਲਚਰ ਨੂੰ 50μg·mL-1 Amp ਵਾਲੇ 50mL ਤਾਜ਼ੇ LB ਤਰਲ ਮਾਧਿਅਮ ਦੀਆਂ 10 ਬੋਤਲਾਂ ਵਿੱਚ 1:100 ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ 'ਤੇ ਵਿਸਥਾਰ ਕਲਚਰ ਲਈ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਜਦੋਂ OD600 ਮੁੱਲ 0.6~0.8 ਸੀ, ਤਾਂ IPTG ਨੂੰ ਅੰਤਿਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਹ 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 ਹੈ। ਉਸੇ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਉਸੇ ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਸ ਤੋਂ 1 ਮਿ.ਲੀ. ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਘੋਲ ਲਿਆ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ 'ਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ IPTG ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ SDS-PAGE ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਡੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਵਾਲੇ IPTG ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਚੋਣ ਕੀਤੀ ਗਈ।
ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਹ ਪਤਾ ਲੱਗੇਗਾ ਕਿ IPTG ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਜਿੰਨੀ ਵੱਡੀ ਹੋ ਸਕੇ ਨਹੀਂ ਹੈ। ਇਹ ਇਸ ਲਈ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ IPTG ਵਿੱਚ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਲਈ ਇੱਕ ਖਾਸ ਜ਼ਹਿਰੀਲਾਪਣ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਤੋਂ ਵੱਧ ਜਾਣ ਨਾਲ ਸੈੱਲ ਵੀ ਮਰ ਜਾਵੇਗਾ; ਅਤੇ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਉਮੀਦ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਸੈੱਲ ਵਿੱਚ ਜਿੰਨਾ ਜ਼ਿਆਦਾ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਓਨਾ ਹੀ ਬਿਹਤਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ ਜਦੋਂ IPTG ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਵੱਡੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ। ਸਰੀਰ, ਪਰ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਘੱਟ ਗਈ। ਇਸ ਲਈ, ਸਭ ਤੋਂ ਢੁਕਵੀਂ IPTG ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਅਕਸਰ ਓਨੀ ਵੱਡੀ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੀ, ਪਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਓਨੀ ਹੀ ਘੱਟ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।
ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੰਜੀਨੀਅਰਡ ਸਟ੍ਰੇਨ ਦੇ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਅਤੇ ਕਾਸ਼ਤ ਦਾ ਉਦੇਸ਼ ਟਾਰਗੇਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣਾ ਅਤੇ ਲਾਗਤਾਂ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣਾ ਹੈ। ਟਾਰਗੇਟ ਜੀਨ ਦੀ ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ ਸਟ੍ਰੇਨ ਦੇ ਆਪਣੇ ਕਾਰਕਾਂ ਅਤੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਪਲਾਜ਼ਮਿਡ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਸਗੋਂ ਹੋਰ ਬਾਹਰੀ ਸਥਿਤੀਆਂ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਇੰਡਿਊਸਰ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ, ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਸਮਾਂ ਦੁਆਰਾ ਵੀ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਲਈ, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਕਿਸੇ ਅਣਜਾਣ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਢੁਕਵੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰਨ ਅਤੇ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨਤੀਜੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਸਮਾਂ, ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ IPTG ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ।
ਪੋਸਟ ਸਮਾਂ: ਦਸੰਬਰ-31-2021